Để có thể làm sáng tỏ bí ẩn này, Nirenberg và Matthaei cần một hệ tự do ngoài tế bào (cell-free system) mà cho phép tổng hợp protein từ các axit amin. Đi theo nghiên cứu của Alfred Tissieres và sau một vài lần thất bại, họ đã tạo ra được một hệ ổn định bằng cách phá vỡ các tế bào của vi khuẩn E. coli giải phóng các thành phần tế bào chất.[12] Hệ này cho phép họ tổng hợp lên protein chỉ khi một loại đúng RNA được thêm vào, và cũng cho phép Nirenberg và Matthaei có thể kiểm soát được thí nghiệm. Họ tạo ra các phân tử RNA tổng hợp bên ngoài tế bào và đưa RNA này vào trong hệ E. coli. Thí nghiệm sử dụng 20 ống nghiệm, mỗi ống chứa một loại axit amin khác nhau. Với từng thí nghiệm, 19 ống nghiệm được trữ "lạnh", và một ống nghiệm chứa axit amin được đánh dấu bằng đồng vị phóng xạ giúp họ theo dõi phản ứng. Ống nghiệm chứa axit amin "nóng" sẽ thay đổi ở mỗi lần họ làm thí nghiệm. Nirenberg muối biết axit amin nào được kết hợp vào protein sau khi ông đưa thêm vào phân tử RNA tổng hợp.

Vào lúc 3 giờ sáng ngày 27 tháng 5, Matthaei sử dụng RNA tổng hợp chỉ chứa uracil (gọi là poly-U) cho vào trong mỗi 20 ống nghiệm chứa tế bào chất của khuẩn E. coli. Lần này Matthaei nhận thấy sự khác biệt ở ống nghiệm “nóng” với sự xuất hiện của phenylalanine. Kết quả này rất ấn tượng và đơn giản ở cùng một thời điểm: sau 1 tiếng, các ống nghiệm cho thấy mức cơ bản đếm được là 70, trong khi ở ống nghiệm nóng đếm được 38.000 trên milligram protein. Thí nghiệm đã chứng tỏ rằng chuỗi các base uracil lặp lại đã tổng hợp lên chuỗi protein chỉ chứa một axit amin lặp lại là phenylalanine.[13] Do vậy, poly-U RNA mã hóa cho polyphenylalanine, chứa bộ ba codon UUU mã hóa cho phenylalanine. Mặc dù ở thời điểm đó, hai ông chưa thể kết luận được số lượng base trong mỗi codon. Hai người giữ bí mật kết quả thí nghiệm này cho đến khi họ hoàn thành được thí nghiệm tương tự tổng hợp protein từ các chuỗi RNA (như Poly-A) và chuẩn bị bài báo công bố. Sử dụng thí nghiệm với poly-U như là mô hình mẫu, Nirenberg cùng các cộng sự khác đã khám phá thêm ra, ví dụ AAA (03 adenine) là codon mã hóa cho axit amin lysine, và CCC (03 cytosine) mã hóa proline. Họ cũng khám phá ra rằng bằng cách thay thế 1 hoặc 2 đơn vị nucleotide trong bộ ba mã hóa, họ có thể điều khiển quá trình tổng hợp protein. Họ tìm thấy, ví dụ, phân tử RNA chứa GUU mã hóa cho valine có thể thêm vào chuỗi axit amin.[11]